冷卻水、冷凝水中嗜肺軍團(tuán)菌檢驗(yàn)方法

　　本附錄規(guī)定了集中空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)冷卻水、冷凝水及其形成的沉積物、軟泥等樣品中嗜肺軍團(tuán)菌的檢驗(yàn)方法。

　　A1原理

　　待測水樣經(jīng)過濾膜或離心濃縮后，一部分樣品經(jīng)酸處理與熱處理，以減少雜菌生長，一部分樣品不作處理。將上述處理與未處理樣品分別接種BCYE瓊脂平板并進(jìn)行培養(yǎng)，生成典型菌落并經(jīng)生化培養(yǎng)和血清學(xué)實(shí)驗(yàn)鑒定確認(rèn)則判定為嗜肺軍團(tuán)菌。

　　A2 主要儀器設(shè)備

　　A2.1 平皿：90mm

　　A2.2 培養(yǎng)箱：35~37℃

　　A2.3 紫外燈：波長360±2nm

　　A2.4 濾膜濾器

　　A2.5 濾膜：孔徑0.22～0.45μm

　　A2.6 蠕動(dòng)泵

　　A2.7 離心機(jī)

　　A2.8 渦旋振蕩器

　　A2.9 普通光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡、體式鏡

　　A2.10 水浴箱

　　A3 采樣

　　A3.1 采樣容器：可選擇玻璃瓶或聚乙烯瓶，沉積物與軟泥需用廣口瓶，容器均需螺口或磨口，用前滅菌。

　　A3.2 采樣量：每個(gè)采樣點(diǎn)依無菌操作取水樣(或沉積物、軟泥等樣品)約200ml。

　　A3.3 中和：經(jīng)氯或臭氧等消毒的樣品，采樣容器滅菌前加入硫代硫酸鈉溶液以中和樣品中的氧化物。

　　A3.4 樣品運(yùn)輸與貯存：樣品最好2天內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，不必冷凍，但要避光和防止受熱，室溫下貯存不得超過15天。

　　A4 方法與步驟

　　A4.1 樣品處理

　　A4.1.1 沉淀或離心：如有雜質(zhì)可靜置沉淀或1000r/min離心1min去除。

　　A4.1.2 過濾：將經(jīng)沉淀或離心的樣品通過孔徑0.22～0.45μm濾膜過濾，取下濾膜置于15ml滅菌水中，充分洗脫，備用。

　　A4.1.3 熱處理：取1ml洗脫樣品置50℃水浴加熱30min。

　　A4.1.4 酸處理：取5ml洗脫樣品，調(diào)pH至2.2，輕輕搖勻，放置5min。

　　A4.2 接種與培養(yǎng)：取A4.1.2洗脫樣品、A4.1.3 熱處理樣品及A4.1.4 酸處理樣品各0.1ml，分別接種GVPC平板。將接種平板靜置于CO2培養(yǎng)箱中，溫度為35~37℃，CO2濃度為2.5%。無CO2培養(yǎng)箱可采用燭缸培養(yǎng)法。觀察到有培養(yǎng)物生成時(shí)，反轉(zhuǎn)平板，孵育10天，注意保濕。

　　A4.3 觀察結(jié)果：軍團(tuán)菌生長緩慢，易被其它菌掩蓋，需每天在體式鏡上觀察。軍團(tuán)菌的菌落顏色多樣，通常呈白色、灰色、藍(lán)色或紫色，也能顯深褐色、灰綠色、深紅色;菌落整齊，表面光滑，呈典型毛玻璃狀，在紫外燈下，有熒光。

　　A4.4 菌落驗(yàn)證：從每一個(gè)平皿上挑取2個(gè)可疑菌落，接種BCYE和L-半光氨酸缺失的BCYE瓊脂平板，35~37℃培養(yǎng)2天，凡在BCYE瓊脂平板上生長而在L-半光氨酸缺失的BCYE瓊脂平板不生長的則為軍團(tuán)菌菌落。

　　A4.5嗜肺軍團(tuán)菌型別的確定：應(yīng)進(jìn)行生化培養(yǎng)與血清學(xué)實(shí)驗(yàn)確定嗜肺軍團(tuán)菌。生化培養(yǎng)：氧化酶(-/弱+)，硝酸鹽還原-，尿素酶-，明膠液化+，水解馬尿酸。血清學(xué)實(shí)驗(yàn)：用嗜肺軍團(tuán)菌診斷血清進(jìn)行分型。

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